شناسایی و به‌دست‌آوردن توالی ژن هدف (ژن‌های انسانی و باکتریایی)
مقدمه: چرا توالی‌یابی ژن هدف این‌قدر مهم است؟
در تکنیک Real-Time PCR که بیشتر با نام qPCR شناخته می‌شود، ما به دنبال تکثیر و اندازه‌گیری دقیق توالی خاصی از DNA یا cDNA در زمان واقعی هستیم.
اما برای اینکه واکنش ما نتیجه دقیق و قابل اعتماد بدهد، باید پرایمرهایی کاملاً اختصاصی و مناسب طراحی کنیم.
برای طراحی پرایمر، اولین قدم دستیابی به توالی دقیق ژن هدف در گونه‌ای است که داریم روی آن کار می‌کنیم (انسان، باکتری یا هر موجود زنده دیگر). اگر این مرحله با دقت انجام نشود، تمام فرایند طراحی پرایمر، واکنش PCR، و تحلیل داده‌ها ممکن است به‌کلی اشتباه باشد.
مرحله ۱: انتخاب ژن هدف (Target Gene)
تعریف ژن هدف:
ژن هدف، ژنی است که می‌خواهید میزان بیان یا حضور آن را با استفاده از qPCR بررسی کنید. این ژن بسته به هدف پروژه شما، می‌تواند متفاوت باشد.
نحوه انتخاب ژن مناسب:
در پروژه‌های انسانی:
- ژن‌های Housekeeping (برای کنترل داخلی):
- GAPDH، ACTB، 18SrRNA
- این ژن‌ها باید بیان پایداری در تمام شرایط داشته باشند.
- ژن‌های هدف بیماری‌زا یا اختصاصی:
- IL-6، TNF-α، VEGF، P53، BAX، BCL2
- این ژن‌ها معمولاً در پاسخ ایمنی، سرطان، التهاب یا آپوپتوز نقش دارند.
در پروژه‌های باکتریایی:
- ژن‌های عمومی شناسایی (Conserved):
- 16S rRNA (برای تشخیص جنس یا خانواده باکتری)
- gyrB، rpoB، dnaK
- ژن‌های خاص و کاربردی:
- mecA (مقاومت به متی‌سیلین در استافیلوکوکوس)
- blaTEM (مقاومت به بتالاکتام‌ها)
- invA (ویژه سالمونلا)
- tuf (برای استرپتوکوکوس)
نکته عملی:
قبل از انتخاب ژن، حتماً با استادت مشورت کن. اگر داری پایان‌نامه یا پروژه تحقیقاتی انجام می‌دی، ببین سایر محققان از چه ژن‌هایی استفاده کردن.
مرحله ۲: یافتن توالی ژن هدف از پایگاه NCBI
چرا از NCBI استفاده کنیم؟
پایگاه داده NCBI (National Center for Biotechnology Information) یکی از معتبرترین و جامع‌ترین منابع ژنومی در دنیاست. تمام توالی‌های ژنی از موجودات مختلف در این پایگاه ثبت شده‌اند و به‌روزرسانی می‌شوند.
گام به گام جستجوی ژن در NCBI
گام اول: ورود به سایت
- وارد شوید به آدرس:
https://www.ncbi.nlm.nih.gov
گام دوم: انتخاب پایگاه مناسب برای جستجو
- در نوار جستجو، از منوی کشویی گزینه “Gene” را انتخاب کنید.
گام سوم: جستجوی ژن مورد نظر
- فرمول جستجو به این صورت است:
[نام ژن] and [نام گونه]
مثال‌ها:
-
- TNF AND Homo sapiens
- gyrA AND Escherichia coli
- پس از جستجو، نتایج را بررسی کرده و روی مورد مربوط به گونه صحیح کلیک کنید.
گام چهارم: ورود به صفحه اطلاعات ژن
در این صفحه اطلاعات زیر را مشاهده خواهید کرد:
- نام کامل ژن و عملکرد آن
- سایر نام‌های شناخته‌شده ژن
- لینک‌هایی به توالی‌های مختلف (ژنومی، mRNA، CDS)
- موقعیت کروموزومی
- نسخه مرجع (RefSeq)
مرحله ۳: استخراج توالی ژن هدف برای طراحی پرایمر
چه نوع توالی‌ای باید دریافت کنیم؟
برای طراحی پرایمر در qPCR (مخصوصاً در بررسی بیان ژن)، معمولاً از توالی mRNA یا CDS (Coding DNA Sequence) استفاده می‌کنیم، نه ژنوم کامل.
تفاوت‌ها:
| نوع توالی | توضیح | مناسب برای |
| Genomic DNA | شامل اگزون + اینترون | برای PCR ژنومی |
| mRNA | بدون اینترون، کامل | برای cDNA synthesis و qPCR |
| CDS | فقط بخش کدکننده (اگزون‌ها) | طراحی پرایمر برای بیان ژن |
مراحل دستیابی به توالی mRNA / CDS
- در صفحه ژن در NCBI، قسمت “Genomic context” را پیدا کن
- بخش “NCBI Reference Sequences (RefSeq)” را بررسی کن
- دنبال آیتمی با فرمت NM_… (mRNA) یا NR_… (non-coding RNA) باش
- روی شماره RefSeq کلیک کن → وارد صفحه Nucleotide می‌شی
- در این صفحه:
- برای دیدن توالی: روی “FASTA” کلیک کن
- توالی رو کپی کن یا با گزینه “Send to > File > FASTA” ذخیره کن
مثال:
برای ژن GAPDH در انسان → شماره RefSeq: NM_002046.7
مرحله ۴: آماده‌سازی توالی برای طراحی پرایمر
حالا که توالی FASTA ژن رو استخراج کردی، باید اون رو آماده بررسی و طراحی پرایمر کنی.
بررسی صحت و نوع توالی
🔹 آیا توالی از نوع mRNA کامل (کدشده) هست؟
🔹 آیا از RefSeq معتبر (NM یا NR) استفاده کردی؟
🔹 آیا توالی به گونه مورد نظر تعلق داره (نه مثلاً Mus musculus به جای Homo sapiens)
تمیز کردن توالی (در صورت نیاز)
- فقط بخش رشته‌ای حاوی A, T, C, G را نگه دار
- هدر FASTA (خطی که با > شروع می‌شود) را در ابزار طراحی وارد نکن
- اگر توالی طولانی است، می‌تونی فقط بخش‌های خاصی را برای طراحی انتخاب کنی (مثلاً یک اگزون خاص یا بخشی از CDS)
نکات پایانی و تجربیات عملی
🔹 اگر هدف بررسی بیان ژن است، مطمئن شو که پرایمرهایت روی اگزون‌های متفاوت یا در محل اتصال اگزون‌ها (Exon-Exon Junction) قرار بگیرند تا از تکثیر DNA ژنومی جلوگیری شود.
🔹 اگر روی باکتری‌ها کار می‌کنی، حتماً توالی‌ای انتخاب کن که مربوط به سوش (Strain) مورد استفاده‌ات باشه. چون تفاوت‌های ژنتیکی حتی بین سوش‌های یک گونه هم می‌تونه زیاد باشه.
🔹 همیشه چند جفت پرایمر طراحی کنید (تا جایگزین داشته باشید).
🔹 با cDNA کار کنید، نه DNA ژنومی (برای بیان ژن).
🔹 در طراحی برای باکتری‌ها، مطمئن شوید که توالی متعلق به strain یا isolate درست باشد.
🔹 اگر از پایگاه NCBI مطمئن نیستید، از Ensembl یا UCSC Genome Browser هم می‌تونید استفاده کنید.
