آنزیم DNA پلیمراز Pfu

توضیحات

آنزیم DNA پلیمراز Pfu آنزیمی نوترکیب و بسیار خالص است که از آرکی‌باکتری گرمادوست Pyrococcus furiosus به‌دست می‌آید. این میکروارگانیسم در شرایط دمایی فوق‌العاده بالا (در حدود ۱۰۰ درجه سانتی‌گراد) در محیط‌های هیدروترمال اعماق اقیانوس‌ها زندگی می‌کند. آنزیم‌های حاصل از چنین موجوداتی قادرند در دماهای بالا بدون از دست دادن فعالیت خود عمل کنند؛ به همین دلیل Pfu DNA Polymerase به عنوان یک آنزیم مقاوم به حرارت (Thermostable) در علوم مولکولی جایگاه ویژه‌ای یافته است.

این آنزیم به خانواده‌ی B از DNA Polymeraseها تعلق دارد و در واکنش‌های PCR وظیفه‌ی پلیمریزاسیون نوکلئوتیدها برای سنتز رشته‌ی مکمل DNA را بر عهده دارد. جرم مولکولی آن حدود ۹۰ کیلو دالتون است و ساختار دقیق آن موجب شده تا در فرآیند تکثیر DNA، حداکثر دقت و صحت را ارائه دهد.

ویژگی‌های کلیدی Pfu DNA Polymerase

• تولید نوترکیب با خلوص بالا، تحت کنترل کیفیت دقیق و پایدار

• برخورداری از فعالیت اگزونکلئازی 3′→5′ برای حذف نوکلئوتیدهای اشتباه

• دارای فیدلیتی بیش از ۱۰ برابر بالاتر از Taq DNA Polymerase

• ایجاد محصولات Blunt-end در PCR

• مقاوم در برابر حرارت بالا و حفظ پایداری طی چرخه‌های مکرر

• مناسب برای واکنش‌هایی که صحت توالی اهمیت حیاتی دارد

مقایسه Pfu DNA Polymerase با Taq DNA Polymerase

دو آنزیم Pfu و Taq از متداول‌ترین پلیمرازهای مورد استفاده در واکنش PCR هستند. هرچند هر دو از باکتری‌های گرمادوست استخراج شده‌اند، اما تفاوت در ساختار و عملکرد باعث شده تا کاربردهای متمایزی داشته باشند.

۱. منشاء و ساختار

Taq DNA Polymerase از Thermus aquaticus استخراج می‌شود و فاقد فعالیت تصحیح‌کننده‌ی 3′→5′ است. در مقابل، Pfu DNA Polymerase از Pyrococcus furiosus مشتق شده و دارای دامنه‌ی Proofreading فعال می‌باشد که نقش آن در حذف نوکلئوتیدهای اشتباه حیاتی است.

۲. دقت (Fidelity)

دقت در تکثیر یکی از معیارهای اصلی انتخاب آنزیم است. از آنجا که Taq فاقد فعالیت تصحیح‌کننده است، خطای آن حدود یک اشتباه در هر ۹۰۰۰ نوکلئوتید است. این امر در کاربردهایی نظیر کلونینگ یا توالی‌یابی می‌تواند منجر به نتایج نادرست شود. در مقابل، Pfu با داشتن فعالیت Proofreading 3′→5′، نرخ خطای حدود ۱ در ۱.۳ میلیون جفت باز دارد؛ یعنی بیش از ده برابر دقیق‌تر از Taq.

۳. نوع انتهای محصولات PCR

Taq محصولات خود را با یک باز “A” اضافه در انتهای 3′ (3′-dA overhang) تولید می‌کند که برای روش TA Cloning مناسب است، در حالی که Pfu محصولات Blunt-end ایجاد می‌کند که برای کلونینگ دقیق با انتهای صاف ایده‌آل است.

۴. سرعت عملکرد

سرعت سنتز در Taq بالاتر است؛ به‌طور میانگین در دمای ۷۲ درجه سانتی‌گراد هر کیلوباز را در یک دقیقه تکثیر می‌کند. در حالی که Pfu برای همان طول حدود دو دقیقه زمان نیاز دارد. با این حال، این کندی در ازای دقت بیشتر، برای پروژه‌های حساس ارزشمند محسوب می‌شود.

۵. پایداری حرارتی

هر دو آنزیم نسبت به حرارت مقاوم هستند، اما Pfu DNA Polymerase در چرخه‌های طولانی PCR و شرایط دناتوراسیون مکرر، ثبات حرارتی بالاتری نسبت به برخی واریانت‌های Taq نشان می‌دهد.

۶. کاربردها

• Taq DNA Polymerase: انتخابی سریع و اقتصادی برای آزمایش‌های غربالگری و PCRهای عمومی

• Pfu DNA Polymerase: مناسب برای پروژه‌هایی با نیاز به دقت بالا مانند:

  • کلونینگ ژن برای بیان پروتئین

  • توالی‌یابی ژنوم یا بخش‌های خاص DNA

  • مهندسی ژنتیک و بررسی جهش‌ها یا SNPها

جدول مقایسه عملکرد

نتیجه‌گیری:
برای پروژه‌هایی که دقت در توالی اهمیت دارد، Pfu بهترین انتخاب است؛ اما در مواردی که سرعت یا هزینه پایین‌تر اولویت دارد، Taq عملکرد رضایت‌بخش ارائه می‌دهد.

مکانیزم عملکرد

در واکنش PCR، Pfu DNA Polymerase همانند یک سیستم تکثیر دقیق عمل می‌کند. در آغاز، دو رشته DNA با حرارت بالا از هم جدا می‌شوند. سپس پرایمرها به نواحی هدف متصل شده و آنزیم، با استفاده از رشته قالب، نوکلئوتیدهای مکمل را یکی‌یکی اضافه می‌کند. ویژگی مهم این آنزیم، فعالیت اگزونکلئازی 3′→5′ آن است که بازهای اشتباه را حذف کرده و مانع تجمع خطا در طول تکثیر می‌شود.

کاربردهای اصلی Pfu DNA Polymerase

• انجام PCR با دقت بالا برای کلونینگ ژن‌ها

• سنتز DNA جهت توالی‌یابی دقیق

• استفاده در Primer Extension Assay

• مهندسی ژنتیک یا جهش‌زایی هدفمند

• مطالعات ساختاری پروتئین (کریستالوگرافی)

ساختار و ویژگی‌های فیزیکوشیمیایی

Pfu DNA Polymerase پروتئینی تک‌زنجیره‌ای با وزن حدود ۹۰ کیلو دالتون است که از دو دامنه‌ی اصلی تشکیل شده است:
۱. ناحیه پلیمراز برای سنتز DNA
۲. ناحیه اگزونکلئاز 3′→5′ برای تصحیح خطا
به همین دلیل، محصولات حاصل از این آنزیم فاقد باز اضافه 3′-A بوده و برای کلونینگ Blunt-end مناسب‌اند.

اجزای کیت Pfu DNA Polymerase پارس توس

• Pfu DNA Polymerase (5 U/μl)

• MgCl₂ Solution (25 mM)

• 5X Pfu Buffer بدون MgCl₂

این کیت در دو اندازه‌ی ۲۵۰ واحدی و ۵۰۰ واحدی عرضه می‌شود که نمونه‌ی بزرگ‌تر از نظر هزینه به‌صرفه‌تر است.

شرایط نگهداری

برای حفظ پایداری و فعالیت آنزیم، محصول باید در دمای منفی ۲۰ درجه سانتی‌گراد نگهداری شود.

جمع‌بندی

اگر هدف پروژه‌ی شما تکثیر DNA با بیشترین دقت و کمترین میزان خطا است، Pfu DNA Polymerase پارس توس انتخابی بی‌رقیب خواهد بود. وجود فعالیت تصحیح‌کننده‌ی 3′→5′، پایداری بالا در دماهای زیاد و کیفیت تضمین‌شده، این آنزیم را به ابزاری مطمئن برای واکنش‌های مولکولی حساس مانند کلونینگ و توالی‌یابی دقیق تبدیل می‌کند.