استخراج DNA فرایندی است که طی آن DNA با کمک ترکیبی از روش‌های فیزیکی و شیمیایی از نمونه جداسازی می‌شود. DNA اولین بار توسط Miescher Friedrich در سال ۱۸۶۹ استخراج گردید. امروزه استخراج DNA یک روش مرسوم در بیولوژی مولکولی و آنالیزهای جرم‌شناسی است. در استخراج به روش شیمیایی، انواع مختلفی کیت وجود دارد که در زمان کمتر، امکان استخراج و انتخاب صحیح DNA را فراهم می‌کند.
روند تهیه و جداسازی DNA کامل از کشت باکتریال را می توان به 4 مرحله تقسیم نمود:
1- یک کشت و رسوب از سلول تهیه شود.
2- سپس سلول ها شکسته می شوند تا محتوای DNA آنها آزاد شود.
3- کلیه محتوای سلول به جز DNA از محیط خارج می شود.
4- محلول DNA به دست آمده تغلیظ می شود.
محیط کشت باید دارای مخلوطی متعادل از مواد مغذی لازم در غلظت هایی که باعث رشد و تکثیر کارآمد باکتری شود، باشد.
برای آماده سازی یک مخلوط محتویات سلولی، باکتری ها باید حتی الامکان در حجم کم آماده شوند. جدا نمودن سلول ها از محیط کشت توسط سانترفیوژ انجام می شود. سانترفیوژ باکتری ها را در ته ظرف ته نشین می کند و در این حالت می توان بقیه محیط کشت را دور ریخت.
تهیه مخلوط محتوای داخل سلولی
سلول باکتری در یک غشای سیتوپلاسمی محصور شده و اطراف آن را نیز دیواره سلولی محکمی فراگرفته است. در برخی باکتری ها از جمله E. coli دیواره سلولی توسط غشای دیگری پوشیده شده است. تمامی این موانع باید از بین بروند تا بتوان محتویات سلول را آزاد کرد.
روش های شکستن باکتری ها به 2 روش کلی فیزیکی و شیمیایی تقسیم می شود :
در روش فیزیکی از نیروهای مکانیکی و در روش شیمیایی از هضم کردن جداره های سلولی با مواد شیمیایی برای باز کردن سلول ها استفاده می شود.
روش های شیمیایی اغلب برای مواردی که هدف به دست آوردن DNA از باکتری است استفاده می شود.
هضم شیمیایی به طور کلی شامل یک عامل حمله کننده به دیواره سلولی و عاملی دیگر برای از بین بردن غشای سلولی می باشد. مواد شیمیایی مورد استفاده بسته به نوع باکتری متفاوت است ولی در مورد E. coli و سایر ارگانیسم های مشابه اغلب از EDTA جهت تضعیف دیواره سلولی استفاده می شود. (در باکتری های گرم مثبت به منظور از بین بردن دیواره از آنزیم لیزوزیم استفاده می شود. لیزوزیم همان آنزیمی است که در سفیده تخم مرغ و ترشحاتی مانند اشک و بزاق یافت می شود و کار آن هضم نمودن ترکیبات پلیمری که باعث سختی دیواره سلولی می باشد، است.)
کار EDTA از کار انداختن یون های منیزیم می باشد که برای حفظ ساختار کلی پوشش سلولی لازم است و همچنین مهار این یون باعث عدم کارکرد آنزیم های هضم کننده DNA می شود. در برخی شرایط، تضعیف دیواره سلولی توسط لیزوزیم یا EDTA برای ترکاندن سلول باکتریایی کفایت می کند ولی اغلب یک ماده شوینده مانند سدیم دو دسیل سولفات (SDS) نیز افزوده می گردد. مواد شوینده از طریق حل کردن مولکول های چربی و از بین بردن آنها باعث کمک به فرآیند لیز غشا شده و در نتیحه منجر به از هم پاشیدن غشای سلولی می شود. پس از لیز نمودن سلول، قدم نهایی در جداسازی مواد خارج شده از سلول از بین بردن بقایای نامحلول است.
استخراج DNA از محتویات سلولی
محتویات سلول باکتریایی علاوه برDNA حاوی مقادیر قابل توجهی از پروتئین و RNA می باشد. روش های مختلفی برای تخلیص DNA از این مخلوط وجود دارد. یکی از روش ها بدین شکل می باشد که به مخلوط، موادی اضافه می نماییم که به غیر از DNA سایر موارد را از بین برده در نهایت محلول خالصی از DNA باقی می گذارد. از سایر روش ها می توان از روش کروماتوگرافی مبادله یونی (ion-exchange charomatography) برای جدا نمودن هر جزء سازنده مخلوط نام برد که با این روش، DNA ها از پروتئین و RNA می توان جدا نمود.
-از بین بردن مواد زائد با استفاده از استخراج ارگانیک (organic extraction) و هضم آنزیمی
روش استاندارد برای از بین بردن پروتئین از محتویات خارج شده سلولی ، اضافه نمودن فنول و کلرفرم به میزان مساوی می باشد. این حلال ها ارگانیک باعث رسوب پروتئین ها می شوند ولی اسیدهای نوکلئیک (RNA, DNA) در حالت حل شده می مانند. نتیجه این است که در صورتی که محتویات سلولی به آرامی با حلال مخلوط شود و سپس سانتریفیوژ انجام شود ، پروتئین ها به صورت لایه سفید رنگ منعقد شده در بین فازهای حلال ارگانیک و محلول آبی جدا می شوند. پس از آن، لایه محلول حاوی اسید های نوکلئیک توسط پیپت برداشته می شود.
در برخی سلول ها ، محتویات پروتئینی به میزانی ست که صرفاً با استفاده از فنول نمی توان تمامی اسید های نوکلئیک را به صورت خالص جدا نمود. این مشکل را می توان با استفاده چندین بار از فنل رفع نمود ولی این روش مغلوب نمی باشد. چراکه هر بار مخلوط کردن با فنول و سپس سانتریفیوژ کردن باعث شکسته شدن تعدادی از مولکول های DNA می شود. لذا راه حل اصلی در استفاده از آنزیم پروتئیناز K، قبل از استفاده فنول می باشد. این آنزیم ها باعث شکستن پلی پپتی ها به قطعات کوچکتر می شود که به راحتی با فنول قابل جداسازی می باشد. برخی مولکول های RNA علی الخصوص RNA ها توسط فنول از مخلوط جدا می شوند ولی بسیاری از آن ها نیز همراه DNA در لایه رویی باقی می مانند. تنها راه از بین بردن RNA ها، استفاده از آنزیم ریبونوکلئاز می باشد که به سرعت این مولکول ها به قطعات ریبونوکلئوتیدی کوچک تقسیم می کند.
روش های دیگر جهت تهیه کل DNA سلولهای دیگر
باکتری ها تنها ارگانیسم هایی نیستند که DNA آن ها ممکن است مورد نیاز باشد. در صورتی که هدف کلون کردن ژن های ارگانیسم های گیاهی یا حیوانی باشد، تمام DNA این نوع سلول ها مورد نیاز می باشد. هرچند اقدامات اساسی استخراج DNA از سلول فارغ از نوع آن مشابه است، ولی با توجه به خصوصیات خاص هر نوع سلول نیز برخی تغییرات در روش ها ممکن است لازم باشد.
مواد شیمیایی که برای تخریب سلول های باکتریایی استفاده می شود اغلب برای سایر ارگانیسم ها مناسب نمی باشد: مثلاً لیزوزیم بر روی سلول های گیاهی اثر ندارد. برای بسیاری از انواع دیواره سلول ها، استفاده از مواد شوینده ی خاص کاربرد دارد، ولی اکثراً استفاده از روش های فیزیکی مانند آسیاب کردن مواد فریز شده با هاون بسیار کارآمد می باشد. در مقابل اغلب سلول های حیوانی فاقد دیواره سلولی بوده و به راحتی توسط یک شوینده از هم می پاشد. نکته مهم دیگری که باید مد نظر قرار داد محتوای بیوشیمیایی سلول هایی است که DNA از آنها استخراج می شود. در بسیاری از باکتری ها، مواد بیو شیمیایی اصلی سلول، پروتئین، DNA و RNA ها می باشد و لذا استفاده از روش استخراج فنولی با همراهی پروتئاز یا هرکدام تنهایی که به دنبال RNA نیز با ریبونوکلئاز از بین برود، باعث باقی ماندن نمونه خالص از DNA می شود.
بافت های گیاهی به علت دارا بودن مقادیر بالایی کربوهیدرات از روشی استفاده می شود که از شوینده ای به نام ستیل تری متیل آمونیوم بروماید(Cetyltrimethylamonium bromide or CTAB) است که با اسیدهای نوکلئیک ترکیب شده و کمپلکس نامحلول ایجاد می کند. هنگامی که CTAB به محتویات یه سلول گیاهی افزوده می شود کمپلکس CTAB-اسید نوکلئیک رسوب می کند و سایر مواد مانند کربوهیدرات ها، پروتئین ها و … در محلول فوقانی باقی می مانند. رسوبات توسط سانترفیوژ به خوبی جدا شده و سپس در یک مولار کلرید سدیم قرار داده می شود که باعث جدا شدن ترکیب نوکلئیک اسید و CTAB می شود.
سپس اسیدهای نوکلئیک با روش رسوب اتانولی جدا شده RNA ها هم با آنزیم RNAase از بین می رود.
روش دیگری که می توان برای انواع محتویات بیوشیمیایی به کار برد روش استفاده از ترکیب گوانیدیوم تیوسیانات می باشد که جهت خالص سازی DNA دو خصوصیت اصلی دارد : این ماده باعث دناتوره شدن حل شدن کلیه مواد بیوشیمیایی به غیر از اسیدهای نوکلئیک شده و در نتیجه می‌تواند باعث استخراج DNA از هر نوع سلول یا بافتی شود دومین خصوصیات آن این است که در حضور تیوسیانات گوانیدیوم دی ان ای با قدرت به ذرات سیلیکا می‌چسبد این عامل باعث سهولت جدا سازی DNA از مخلوط بیوشیمیایی دناتوره می‌شود برای استفاده از این خصوصیت می‌توان سیلیکا را مستقیماً به محتویات سلول اضافه نمود ولی راحت تر این است که از ستون کروماتوگرافی استفاده شود بدین شکل که سیلیکا در ستون قرار داده می‌شود و سپس محتویات سلولی به آن افزوده می گردد بدین ترتیب DNA به سیلیکا متصل شده و داخل ستون می‌ماند در حالی که سایر مواد دنا طور شده از ستون رد می شوند بعد از شستن آخرین باقیمانده های سایر مواد در ستون با گوانیدیوم تیوسیانات با افزودن آب به ستون که باعث سست شدن اتصال DNA و سیلیکا می‌شود از ستون جدا و خارج می‌شود.
www.sciencelearn.org.nz/resources/2036-dna-extraction
