PCR یا واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) در زیست‌شناسی مولکولی به منظور ساخت میليون‌ها کپي از قطعه DNA موردنظر، به‌کارمی‌رود. این تکنیک برای نخستين بار در سال ۱۹۸۳ توسط Kary Mullis، شیمی‌دان آمریکایي، ابداع شد. وي به مناسبت اين دستاورد مهم در سال ۱۹۹۳ برنده جايزه نوبل گرديد. PCR امکان تولید میلیون‌ها نسخه از یک قطعه مشخص موجود در مقادير اندک DNA را فراهم می‌کند.
مدت زمان کوتاهی پس از اختراع PCR توسط مولیس، این تکنیک، انقلابی را در بيولوژي مولکولي پديد آورد و باعث افزايشي ناگهاني در سرعت پيشرفت مطالعات ژنومي شد. امروزه با استفاده از PCR قادر به بررسی هر ژنی از هر ارگانیسمی هستیم. سرعت و حساسيت بسيار بالا تکنیک PCR، آن را به تکنیکی معمول در تحقیقات آزمایشگاهي پزشکي و زيست‌شناسي تبديل كرده است.
عدم نیاز به باکتری‌ها برای تکثیر،PCR را به روشی سریع و آسان تبدیل کرده‌است؛ خصوصا اگر توالی کامل ژنوم ارگانيسم مشخص باشد. از این تکنیک در پردازش DNA برای توالی‌یابی، تعيين وجود يا عدم وجود يک ژن خاص به منظور تشخيص عامل عفونت و تهيه پروفايلDNA در تحقیقات جنایی استفاده می‌شود. حساسيت PCR بسیار بالاست؛ به‌طوری‌که می‌تواند مقدار کم DNA موجود در قطره خون به‌جامانده در صحنه جرم، و یا نسخه‌های اندکی از ژنوم ویروسي موجود در خون بيمار را تشخيص دهد.
تکنیک PCR با بهره‌گیری از اصول اولیه فرایند طبيعي سنتز DNA و همانندسازی، مولکول‌های DNA را در داخل لوله آزمایش کپی می‌کند. در داخل سلول‌های زنده، سيستمي پيچيده که متشکل از تعداد فراواني پروتئين است، همانندسازي ژنوم را انجام مي‌دهد: دو رشته DNA از هم باز می‌شوند و هر رشته مولکول مادر به عنوان الگویی برای توليد رشته‌هاي مکمل دختر مورد استفاده قرار مي‌گيرد. اساس اين نسخه برداري، همان قانون معروف واتسون و کريک است: A همواره با T و G همواره با C جفت می‌شود. PCR مشابه یک دستگاه فتوکپی است و همانند این دستگاه که نیاز به موادي مثل کاغذ، جوهر و سخت‌افزار دارد، PCR نیز نیازمند مواد اولیه خاصی است. پنج جزء اصلي براي انجام PCR مورد نیاز است که در ادامه به نقش دقیق هر کدام از آن‌ها بیشتر خواهیم پرداخت:
نمونه DNA ای که قرار است از آن کپی تهیه شود.
رشته‌های کوتاهی از DNA به نام پرایمرها، که آغازگر واکنش PCR هستند. پرایمرها به‌گونه‌ای طراحی می‌شوند که بتوانند از سمت 3′ هر دو رشته به توالي موردنظر متصل شوند؛ از اين رو به دو نوع پرايمر نياز خواهيم داشت.
نوکلئوتیدها (dNTPها) که واحدهای ساختمانی DNA بوده و برای ساخت رشته جدید مورد نیاز می‌باشند.
آتزیم Taq پلیمراز که بازهای جدید را به ساختار DNA می‌افزاید.
بافر که شرایط مناسب انجام آزمایش PCR را فراهم می‌کند.
در PCR گرم کردن و سرد کردن به‌صورت پشت سر هم و توسط دستگاه انجام می‌گیرد. این فرایند چرخه حرارتي نام دارد.
آزمایش PCR سه مرحله اصلی دارد:
دناتوراسیون (DNA Denaturation) :دورشته‌ای حرارت داده می‌شود تا به دو DNA تک‌رشته‌ای تبدیل شود.
اتصال (Annealing) : دما به میزانی پایین آورده مي‌شود تا پرايمرها بتوانند به رشته الگو متصل شوند.
گسترش (Extending) : با افزایش دما، رشته جدید توسط آنزیم Taq پلیمراز شروع به ساخته‌شدن می‌کند.
این سه مرحله، ۲۰ الی ۴۰ بار تکرار می‌شوند و در هر مرتبه تعداد کپی‌هاي تهيه شده از هر DNA دو برابر می‌شود.
یک آزمایش PCR می‌تواند در کمتر از یک ساعت به طور کامل به انجام برسد. البته مدت زمان انجام آن به سرعت دستگاه‌ها نیز بستگی دارد.
پس از انجام شدن PCR، از تکنیک الکتروفورز برای بررسی تعداد قطعات تولید شده و اندازه آن‌ها استفاده مي‌شود.
مراحل اصلی PCR
مرحله دناتوراسیون
طی این مرحله تمام پنج جزء اصلی نام برده شده از جمله DNA الگو تا دمای ۹۵-۹۴ درجه سانتیگراد حرارت داده می‌شوند. دمای بالا باعث از هم گسستن پیوندهای هیدروژني بين بازها شده و دو رشته DNA جداگانه حاصل می‌گردد. این دو رشته به‌عنوان الگویی برای ساخت رشته‌هاي جديد DNA عمل می‌کنند. مدت زمان افزایش دما تا این حد باید به میزاني باشد که تمام مولکول‌هاي DNA دو رشته‌ای شوند. این فرایند معمولا ۳۰-۱۵ ثانیه طول می‌کشد.
مرحله اتصال
در این مرحله، دما تا حدود ۶۵-۵۰ درجه سانیگراد پایین مي‌آيد. درنتيجه پرايمرها با پيوند هيدروژني به نقاط اتصال مخصوص به خود در DNA تک رشته‌ای متصل می‌شوند. البته دمای دقیق به نقطه ذوب پرايمر مورد استفاده بستگي دارد.
پرایمرها توالی‌های تک‌رشته‌ای DNA هستند که طولی به اندازه 18-22 باز دارند و انتهای 3′ مورد نیاز براي آغاز فعاليت پليمراز و سنتز DNA را تهیه می‌کنند. پرایمرها توسط آزمایش‌گر به گونه‌ای طراحی و ساخته مي‌شوند که توالي‌شان مکمل دو انتهاي 3′ توالي DNA موردنظر باشد. پس از اتصال پرایمر است که پليمراز نيز متصل شده و ساخت رشته مکمل را آغاز مي‌کند.
دو رشته جدا شده DNA مکمل هم بوده ولی در دو جهت متفاوت قرار دارند (منظور از جهت نحوه قرارگیری انتهاهای 3′ و 5′ است). در نتيجه ۲ نوع پرايمر خواهيم داشت: Forward Primer و Reverse primer. این مرحله ۳۰-۱۰ ثانیه زمان می‌برد.
مرحله گسترش
طی این مرحله، دما تا ۷۲ درجه سانتیگراد افزایش داده مي‌شود. درنتيجه آنزيم Taq DNA پلیمراز فعال شده و افزودن بازهای آلی و سنتز رشته جدید را از سمت ۵ پريم به ۳ پريم شروع مي‌کند.
Taq DNA پلیمراز آنزیمی است که از نوعی باکتري گرمادوست به نام Thermus aquaticus گرفته‌شده‌است.
محیط زندگی این باکتری غالبا چشمه‌هاي آب گرم است و در نتيجه مي‌تواند حرارت بالاي ۸۰ درجه سانتيگراد را تحمل کند.
DNA پلیمراز باکتری، در دماهای بالا پایدار است. اين به آن معني است که مي‌تواند دماي بالايي را که براي جدا کردن دو رشته DNA از همدیگر در مرحله دناتوراسیون مورد نیاز است، تحمل کند. در نتیجه افزودن آنزيم پس از هر بار انجام شدن چرخه، مورد نياز نخواهد بود.
DNA پلیمراز بسیاری از ارگانیسم‌ها قادر به تحمل اين دما نيست. به عنوان مثال، دماي مناسب براي فعاليت پليمراز انساني ۳۷ درجه سانتيگراد است.
دمای بهینه آنزیم Taq DNA پلیمراز ۷۲ درجه است. این آنزیم به پرایمر متصل شده و نوکلئوتيدها را به DNA تک رشته‌ای می‌افزاید.
مدت زمان این مرحله بستگی به طول توالی موردنظر دارد. کپی شدن هزار باز DNA حدود یک دقیقه زمان می‌برد.
با تکرار چرخه توضیح داده شده، قطعات جدید در چرخه هاي بعدي به عنوان الگو عمل مي‌کنند. از آن‌جا که پليمرازها و پرايمرها در مخلوط باقي مي مانند، تنها كاري كه بايد انجام شود، گرم‌كردن و سردكردن پي‌در‌پي مخلوط است. هر چرخه مقدار DNA سنتز شده در چرخه های پیشین را دو برابر می‌کند؛ از اين رو پس از چند چرخه، DNA غالب، نسخه‌های جدید تولید شده از توالی مورد نظر است. به عنوان مثال، از ۳ چرخه انجام شده در مجموع ۱۶ عدد DNA تولید شده که ۸ تای آن‌ها از لحاظ توالی منطبق بر یکي از دو رشته توالي دلخواه هستند. پس از سپري شدن ۴ چرخه ديگر، ۲۴۰ قطعه از کل ۲۵۶ قطعه توليدشده، منطبق بر توالي موردنظر خواهند بود. معمولاً پس از انجام ۲۰-۳۰ چرخه، کلون ناحيه موردنظر به شكل مؤثري انجام گرفته و غلظت بقيه ژنوم در مقايسه با ناحيه كلون‌شده، قابل چشم پوشي مي‌شود.
چرخه حرارتی که شامل این سه مرحله است، ۲۰ تا ۴۰ مرتبه تکرار می‌شود و هر چرخه نیز حدود ۵ دقيقه به طول مي‌انجامد تا کپي‌هاي فراواني از قطعه DNA دلخواه ما تهیه شود.
قطعات DNA جدیدی که حین PCR تولید می‌شوند نیز به عنوان الگو عمل کرده و Taq DNA پلیمراز به این قطعات متصل شده و رشته جدید را تولید مي‌کند.
نتیجه تولید میلیون‌ها کپي از بخش خاصي از DNA در مدت زمانی بسیار کوتاه است.
PCR بهترین روش موجود برای کلون کردن قطعات نسبتا کوتاه DNA (کمتر از ۱۰۰۰۰ جفت نوکلئوتید) است. قطعات RNA نیز می‌توانند با این روش کپی شوند اما ابتدا بايد تحت تاثير آنزيم رونوشت بردار معکوس (Reverse Transcriptase) به صورت DNA دربیایند.
حساسیت PCR بسیار بالاست و می‌تواند عوامل بیماری‌زا را حتي در مراحل اوليه عفونت تشخيص دهد. در اين گونه موارد، توالي‌هاي کوتاهي که مکمل ژنوم عامل بيماري‌زا هستند، ساخته و به عنوان پرايمر مورد استفاده قرار مي‌گيرند. پس از انجام چرخه‌هاي متعدد، حتي نسخه‌هاي اندک ژنوم باكتريايي يا ويروسي قابل تشخيص هستند.
پرایمرها
PCR نیازمند سنتز یک سری توالی‌هاي اليگونوکلئوتيدي است که در سنتز DNA جدید به صورت انتخابی، به عنوان پرایمر عمل می‌کنند. پرايمرها در موفقيت PCR و یا شکست آن نقشی کلیدی دارند. در صورت طراحي صحيح پرايمرها، آزمايش منجر به تکثير يک قطعه DNA واحد می‌گردد که منطبق بر ناحیه هدف در مولکول الگو است. در صورت طراحی نادرست، واکنش با شکست روبه‌رو خواهد شد.
تعیین توالی مناسب برای پرايمر کار دشواري نيست: پرايمرها، اختصاصي دو توالي بلافاصله مجاور ناحيه هدف بوده و طولي در حدود ۱۸ تا ۲۵ نوکلئوتيد دارند. براي اينکه هيبريداسيون بتواند اتفاق بيفتد، هر پرايمر بايد از لحاظ توالي مکمل رشته هدف باشد. همچنين انتهاي ۳’ دو پرايمر مورد استفاده بايد به سمت يكديگر قرار بگيرند.
سنتز پرایمرها از روی توالی‌های هدف معيني صورت مي‌گيرد، پس به اين منظور بايد اطلاعاتي در مورد اين توالي‌ها داشته باشيم. در حالت ايده‌آل، قطعات DNA موردنظر نیز نباید طولی بیش از ۳ کيلوباز و کمتر از يک کيلوباز داشته باشند. البته قطعاتي با طول بيش از ۱۰ كيلوباز نيز مي‌توانند با تكنيك‌هاي PCR استاندارد تکثیر شوند، اما این نکته را نیز باید مدنظر داشت که با افزايش طول قطعات، بازده فرايند تکثير كاهش خواهد يافت.
آزمایش PCR – پرایمرها
طول پرایمرها از جمله مهم‌ترین پارامترها در سنتز پرایمر است. در صورتیکه پرايمرها کوتاه‌تر از حد باشند، ممکن است به نقاط غيراختصاصي متصل شده و محصولات غيراختصاصي توليد کنند. به عنوان مثال، در صورتيكه در يك آزمايش PCR، برای DNA توتال انسانی از پرایمری ۸ نوکلئوتیدي استفاده شود، به احتمال زياد، قطعات مختلفي تکثير خواهند شد.
حال سوال این است که چرا پرایمرهای طولانی‌تري ساخته نمي شوند؟ طول پرايمر سرعت هيبريداسيون آن با DNA هدف را تحت تاثیر قرار می‌دهد و پرایمرهای کوتاه‌تر با سرعت کمتري هيبريد مي‌گردند. درنتيجه کارايي PCR که بر اساس تعداد قطعات تکثیرشده در حین آزمایش تعیين مي‌گردد، کاهش خواهد يافت. علت اين موضوع ، افزايش طول پرايمرها و عدم هيبريداسيون کامل آن‌ها با توالي الگو در مدت زمان تعيين شده در چرخه مي‌باشد. پرايمرهاي با طول بيش از ۳۰ نوكلئوتيد ندرتا مورد استفاده قرار مي‌گيرند.
در بسیاری از واکنش‌ها هدف تکثیر یک توالي DNA واحد است؛ در این موارد، از اهداف مهم، کاهش احتمال اتصال پرایمر به نقاطی غیر از نقطه موردنظر است. پس نبايد از توالي‌هاي تکراري استفاده نمود. به منظور حصول اطمينان از مکمل نبودن بازهاي داخل يک پرايمر با يكديگر، توالي پرايمر نبايد محتوي تكرارهاي معكوس (inverted repeats) و یا هر گونه توالی self-complementary با طولی بیش از ۳ جفت‌باز باشد. به منظور جلوگیری از اتصال دو پرايمر به يکديگر و تشکيل دايمر پرايمر، توالي ۳’ هيچ يک از پرايمرها نبايد در هيچ کدام از جايگاه‌ها مكمل خود و يا پرايمر دوم باشد.
دایمرهای پرایمر، محصول گسترش پرایمر از روي خود و يا پرايمري ديگر هستند. از آن‌جايي که اين محصولات حاوي توالي يکي از پرايمرها و يا هر دوي آن‌ها و نيز توالي مکمل اين پرايمرها هستند، الگوي مناسبي براي واکنش‌هاي تكثير بعدي فراهم مي‌كنند. نسخه‌برداري آسان‌تر مولكول‌هاي كوچكتر باعث بدتر شدن شرايط نيز مي‌شود. دايمرهاي پرايمر مي‌توانند در واكنش PCR غالب شده و پرایمر ار از توالی هدف حقیقی خود جدا نمايند.
کاربردهای PCR
1) جداسازی انتخابی یک قطعه از DNA
2) بررسی عوامل میکروبی در بیماری های عفونی
3) بررسی و شناسایی نمونه های پزشکی قانونی 4) بررسی های تحقیقاتی
