RNA یک توالی تک رشته ای است، در حالی که DNA غالبا دورشته ای است. استخراج RNA دشوارتر است، زیرا تجزیه کننده های RNA در محیط اطراف(سطوح و …) و نیز در داخل سلول ها فراوان هستند و زدودن کامل آن ها از محیط بسیار دشوار است. از این رو استخراج RNA نیاز به دقت در دستکاری نمونه ها و تکنیک های پاکسازی مناسب دارد. همچنین مولکول های RNA نسبتا کوتاه هستند و حین پاره کردن سلول ها کمتر از DNA آسیب می بینند؛ درنتیجه می توان مرحله تخریب سلول ها را با شدت بیشتری انجام داد.
نخستین گام در استخراج RNA، جمع آوری نمونه و حفاظت از آن است. استفاده از بهترین روش تخریب سلول ها یا بافت ها متناسب با نوع نمونه مورد استفاده در به حداکثر رساندن محصول و کیفیت فرایند آماده سازی RNA تاثیر فراوانی دارد. بلافاصله پس از انجام گرفتن مرحله تخریب نمونه، ماده لیز کننده یا دناتوره کننده باید بتواند در تماس با محتویات سلولی قرار بگیرد. این موضوع همیشه امکان پذیر نیست؛ به عنوان مثال در صورتی که سلول ها و بافت ها سخت باشند(مانند استخوان)، یا حاوی دیواره سلولی و یا کپسول باشند(اسپور ها، مخمر ها، باکتری های گرم مثبت)، فرایند کار به گونه ای باشد که پردازش نمونه بلافاصله پس از جمع آوری آن امکان پذیر نباشد(انتقال از محل جمع آوری به محلی دیگر به منظور پردازش) و یا زمانی که تعداد نمونه ها فراوان باشد و امکان پردازش سریع هر یک از آن ها فراهم نشود.
راه حل این مسئله معمولا منجمد کردن سلول ها و یا بافت مورد نظر در نیتروژن مایع و یا یخ خشک است. نمونه های منجمد شده غالبا ابتدا مورد پردازش قرار می گیرند تا توده مورد نظر انتخاب شود و یا اینکه قبل از تماس با مواد لیز کننده پودر می شوند. با اینکه منجمد و سپس پردازش کردن نمونه به محققان امکان کنترل بیشتری روی شرایط خالص سازی می دهد، تجربه نشان می دهد که این فرایند ها پیچیده و زمان بر هستند و نیاز به نیروی انسانی بیشتری دارند.
راه حل بهتر، استفاده از محلول های پایدار کننده RNA است. با استفاده از این مواد می توان استخراج RNA را برای روز ها، هفته ها و حتی ماه ها پس از جمع آوری نمونه به تعویق انداخت، بی آن که ساختار RNA دچار تخریب شود. مقاطع بافتی، مایعات بدن و سلول های تهیه شده می توانند در داخل این نوع از محلول ها قرار بگیرند و با نفوذ این مواد به داخل سلول ها پایداری RNA افزایش خواهد یافت.
تهیه RNA
چندین تکنیک به منظور تهیه RNA وجود دارد و این تکنیک ها قابل دسته بندی در چهار گروه می باشند: روش های استخراج آلی، انواع روش هایی که به اصطلاح به آن ها چرخش سبد گفته می شود، استفاده از ذرات مغناطیسی و تکنیک های لیز مستقیم. به منظور انتخاب تکنیک مناسب باید میزان دشواری پردازش نمونه(که با بالا بودن نوکلئاز ها و وجود مقادیر زیاد چربی در بافت و یا مهار کننده ها افزایش می یابد)، مقدار نمونه ای که باید مورد پردازش قرار بگیرد و ظرفیت ورودی مورد نیاز، مورد توجه قرار بگیرد.
تکنیک های استخراج ارگانیک
تکنیک های استخراج ارگانیک در فرایند تهیه RNA به کار می رود. واکنشگر ترایزول، به صورتی آسان قابل استفاده است و در عین حفاظت از ساختار RNA حین هموژن سازی(یکسان سازی) بافت، سلول ها و سایر ساختار های سلولی را تخریب می کند. از جمله مزایای این تکنیک ها دناتوره کردن سریع نوکلئاز ها و پایدارسازی RNA و نیز مقیاس پذیر بودن آن است. همچنین این فرایند برای تمام انواع بافت ها از جانوری تا گیاهی قابل استفاده است. البته این تکنیک ها معایبی نیز دارند که از جمله آن ها استفاده از مواد آلی کلردار و مواد زاید حاصل از آن ها، نیاز به تعداد زیاد نیروی انسانی و پردازش دستی و دشواری کنترل و هدایت دستگاهی به طور خودکار می باشد.
از جمله مهم ترین مواد مورد نیاز برای استخراج RNA که به این شیوه مورد استفاده قرار می گیرد، واکنش گر ترایزول است. این ماده حاوی فنول، گوانیدین تیوسینات، آمونیوم تیوسینات و بافر سدیم استات می باشد. کلروفورم، ایزوپروپرانول، اتانول و لوله اپندورف و دستگاه سانتریفوژ از جمله سایر مواد و تجهیزات مورد نیاز هستند. گوانیدین تیوسینات و کلراید از جمله موثرترین دناتوره کننده های پروتئین می باشند و علاوه بر آن مهار کننده شدید ریبونوکلئاز ها نیز می باشند. استفاده از گوانیدینیوم کلرید به عنوان تجزیه کننده پروتئین برای نخستین بار توسط کوکس و در سال ۱۹۶۸ انجام پذیرفت.
این فرایند هم برای سلول و هم برای بافت قابل استفاده است. در صورت استفاده از نمونه سلولی، حداقل 10 به توان 6 سلول باید از کشت سلولی تنفس کنند و سپس ترایزول افزوده گردد. در صورتی که نمونه مورد نظر، نمونه بافت باشد، ابتدا ترایزول و سپس نمونه بافت منجمد به لوله کشت استریل اضافه می شود و بر روی یخ توسط یک همگن کننده، پودر می شود. در هر دو مورد مخلوط ترایزول و سلول های لیز شده به لوله اپندورف اضافه می گردد. پس از انکوبه گذاری در دمای اتاق، کلروفورم افزوده می شود و مجددا انکوبه گذاری انجام می گیرد.
مرحله بعدی، سانتریفوژ مخلوط حاصل است. با انجام این کار در هر لوله سه لایه تشکیل می شود: لایه بالایی که صاف و محلول آبی رنگ است، لایه حدواسط که DNA است که به رنگ سفید مشاهده می شود، و لایه پایینی که لایه صورتی رنگ است، مواد آلی می باشد. RNA تنها واقع در لایه آبی رنگ است. لایه آبی رنگ باید به دقت و توسط پیپت برداشته و در داخل لوله اپندورف دیگری ریخته شود. سپس به ترتیب ابتدا ایزوپروپانول افزوده شده و سانتریفیوژ گردیده و بعد از آن بیرون ریختن ایزوپروپرانول انجام می گیرد؛ سپس این مراحل برای اتانول نیز تکرار می شود. هدف از انجام این موارد، رسوب RNA و جداسازی DNA و پروتئین است.
در فرایند استخراج RNA باید DNA ها و پروتئین های موجود تجزیه شوند. تجزیه DNA با استفاده از محلول تجزیه کننده DNA(DNase) فاقد RNase(تجزیه کننده RNA) و در داخل دستگاه Thermal cycler یا thermocycler یا چرخه حرارتی یا همان دستگاه PCR انجام می گیرد. از آن جایی که RNA اتصال محکمی با پروتیئن ها دارد، تجزیه پروتئین ها نیز باید صورت بگیرد.
تکنیک های چرخش سبد با استفاده از فیلتر
در این تکنیک ها از غشا هایی استفاده می شود که در کف سبد پلاستیکی کوچکی قرار می گیرند و جنس شان معمولا از فیبر شیشه ای، سیلیکا و غشا های مبادله کننده یون هاست. در این حالت نمونه ها توسط بافری که حاوی مهار کننده های RNase(آنزیم تجزیه کننده RNA) مانند نمک های گوانیدین است، لیز می شوند. با نیروی سانتریفیوژ، نوکلئیک اسید ها در اثر گذر نمونه ی لیز شده از غشا، به آن متصل می شوند. سپس یک محلول شست و شوی مناسب مورد استفاده قرار می گیرد و نمونه به وسیله سانتریفیوژ در داخل لوله جمع آوری می گردد.
سهولت استفاده، امکان کنترل و هدایت دستگاهی به طور خودکار، امکان ساخت غشا هایی با ابعاد متفاوت از جمله مزایای این تکنیک ها و توقف واکنش توسط تعدادی از مواد، آلودگی توسط نوکلئیک اسید های بزرگی مانند gDNA، ظرفیت اتصال ثابت(تعیین‌شده توسط تولیدکننده)، و نیاز به سیستم های پیشرفته سانتریفیوژ در اثر کنترل و هدایت دستگاهی به صورت خودکار از جمله معایب آن هاست.
تکنیک های استفاده از ذرات مغناطیسی
در این روش ها از ذرات کوچکی استفاده می شود که حاوی هسته پارامغناطیسی و نیز پوسته ای هستند که به مواد مورد نظر متصل می شود. ذرات پارامغناطیسی در اثر مواجهه با میدان، در داخل آن حرکت می کنند، اما پس از حذف میدان این خاصیت را از دست می دهند. در نتیجه در اثر فعل و انفعال ذرات با مولکول های دلخواه بر اساس ویژگی های سطحی شان، پس از برقراری میدان الکتریکی خارجی، مواد مورد نظر به سرعت جمع آوری شده و با از بین رفتن میدان، مجددا به حالت شناور در می آیند. در این فرایند نمونه ها در محلولی حاوی مهار کننده های RNase قرار گرفته و در معرض اتصال به ذرات مغناطیسی قرار داده می شوند. با اِعمال میدان مغناطیسی، ذرات مغناطیسی و مولکول های مربوطه جمع آوری می شوند. پس از چندین مرحله، RNA در یک محلول شست و شو قرار می گیرد و ذرات متصل شده جداسازی می شوند.
عدم وجود خطر مهار شدن فیلتر، جمع آوری سریع مولکول های RNA به علت ماهیت مغناطیسی تکنیک، وجود امکان کنترل و هدایت دستگاهی به طور خودکار، وجود انواع گسترده ای از مولکول های سطحی، از جمله مزایای این تکنیک ها، و وجود احتمال بقای ذرات مغناطیسی پس از قرارگیری در محلول های شست و شو، جا به جایی آهسته ذرات مغناطیسی در محلول های چسبناک و نیاز به تعداد زیاد نیروی انسانی در صورت انجام دستی فرایند از جمله معایب آن ها است.
تکنیک های لیز مستقیم
این تکنیک ها مرحله تهیه نمونه را با استفاده از بافر های لیز کننده ای که نمونه را تخریب و نوکلئیک اسید ها را پایدار می کنند، انجام می دهند و با آنالیز هایی که در مراحل بعدی انجام می گیرد سازگار هستند. به طور معمول طی این فرایند نمونه با مواد لیز کننده مخلوط و برای مدتی تحت شرایط مشخص انکوبه می شود و سپس به طور مستقیم به منظور آنالیز های بعدی مورد استفاده قرار می گیرد. در صورت استفاده از این روش ها نیاز به اتصال به سطوح جامد و سپس جداسازی از آن ها از بین می رود. در نتیجه از خطا و تفاوت در کارایی فرایند های بازیابی که ممکن است در سایر روش ها رخ دهد، جلوگیری به عمل می آید.
این روش ها که داری بالاترین پتانسیل استخراج دقیق RNA می باشند، می توانند در شرایطی که میزان نمونه اندک است مورد استفاده قرار گیرند و دارای قابلیت کنترل و هدایت دستگاهی به طور خودکار هستند. عدم امکان انجام روش های آنالیز قدیمی مانند اسپکتروفوتومتری، وابستگی به غلظت(در نمونه های غلیظ بهتر انجام می شود)، احتمال عملکرد غیر بهینه و احتمال بقای فعالیت RNase در صورتی که مواد لیز کننده به درستی مهار نشوند، از معایب به کارگیری این تکنیک است.
نکته ای که در تمام این تکنیک ها باید مورد توجه قرار بگیرد این است که RNA بسیار ناپایدار است؛ درنتیجه تمام واکنش گر ها و مواد مورد استفاده در پردازش نمونه باید به گونه ای مورد استفاده قرار بگیرند که هیچ گونه فعالیتی از جانب آنزیم RNase مشاهده نشود. استفاده از دستکش، به‌کارگیری حلال های قوی در محلول های استخراج(به نحوی که فورا هر گونه RNA ای را دناتوره کنند) و صحبت نکردن در حالتی که لوله ها در تماس با بیرون هستند، می تواند به میزان زیادی به تهیه مولکول های RNA پایدار کمک کند.
استخراج RNA با کیفیت، غالبا مهم ترین مرحله در بسیاری از تکنیک های مولکولی مانند RT-qPCR، آنالیز ترانس‌کریپتو میکس با استفاده از توالی یابی نسل بعدی، PCR دیجیتال، تولید کتابخانه cDNA و… است. از آن جایی که RNA از لحاظ ساختاری بسیار با DNA متفاوت است، تکنیک های استخراج DNA نمی توانند به طور مستقیم به منظور استخراج RNA مورد استفاده قرار بگیرند.
استخراج RNA با کیفیت بالا از گیاهان دارویی و محصولات کشاورزی که حاوی مقادیر بالای آلکالوئید ها و پلی فنل ها می باشند، همیشه یک چالش بزرگ برای دانشمندان بوده است. سیب از جمله گیاهانی است که حاوی مقادیر زیادی از ترکیب های پلی ساکارید و پلی فنلی از قبیل فلاونوئید ها و فنلیک اسید ها می باشد و مانع از استخراج RNA با کیفیت بالا می گردد، زیرا ترکیب های فنلی به راحتی به شکل کوئینون اکسید شده و به نوکلئیک اسید ها متصل می گردند که در نتیجه آن، کیفیت و کمیت RNA به شدت کاهش می یابد و غیر قابل استفاده برای سنتز cDNA، RT-PCR، Real-time می شود.
در دنیا، روش متداول استخراج، استفاده از کیت می باشد، ولی کیت معمولا گران قیمت است و برای هر گیاهی به صورت اختصاصی باید مورد بررسی قرار گیرد. اگر چه چندین پروتکل برای جداسازی RNA در گیاهانی با ترکیبات پلی فنل و پلی ساکارید بالا گزارش شده است، اما کیفیت و عملکرد RNA استخراج شده در آن ها مطلوب نمی باشد. از این جهت، روش های مختلف استخراج RNA باید آزمایش و بهینه شوند و روشی انتخاب گردد که سریع، ساده و اقتصادی بوده و آلودگی آن به مواد شیمیایی مورد استفاده کم باشد.
www.zymoresearch.com/pages/what-is-trizol
